какие факторы и как будут влиять на скорость электрофореза

Электрофорез.

Электрофорез (от электро… и греческого рhoresis – перенесение) – направленное перемещение заряженных частиц в дисперсионной среде под действием внешнего постоянного электрического поля к противоположно заряженному электроду.

Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как

размеры (или молярная масса),

причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим зарядом мигрируют в направлении катода или анода. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса разделения смеси белков методом электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны или фракции, содержащие одинаковые молекулы.

Факторы, влияющие на электрофоретическую подвижность

Молекула белка в растворе при любом значении рН, отличающемся от изоэлектрической точки, имеет определенный заряд. Это приводит к тому, что белок движется в электрическом поле (макрокатион к катоду, макроанион к аноду). На электрофоретическую подвижность белковых молекул влияют следующие факторы:

Размер и форма макромолекулы.

Чем больше величина заряда белковой молекулы, тем выше ее электрофоретическая подвижность из-за увеличения силы электростатического притяжения с противоположно заряженным электродом.

Напряженность электрического поля (Н, В/м)

Характер буферного раствора

Электрофорез сыворотки крови обычно проводят при нейтральных или слабощелочных рН = 8,6, когда большинство белков мигрирует к аноду.

Чаще всего в качестве носителей используют относительно инертные вещества, но их состав все же оказывает влияние на подвижность разделяемых веществ, и, выбор носителя зависит от природы образца.

Методы электрофореза

Существует множество разновидностей и модификаций метода электрофореза, которые используются в различных областях.

Выделяют три основных типа электрофоретических систем: электрофорез с подвижной границей, зональный электрофорез и стационарный (вытесняющий) электрофорез.

Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков. В случае использования иммунологических методов для выявления разделенных белков используется иммуноэлектрофорез.

Зональный электрофорез

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. При этом методе разделение производят в закрепленной среде. Наиболее распространены методы разделения на пористых носителях.

Электрофорез на бумаге. Электрофорез проводят с использованием боратных, фосфатных или веронал-мединаловых буферных растворов. Носителем служит специальная хроматографическая бумага, которую разрезают на полоски требуемого размера. Наносят сыворотку крови на катодный конец смоченной буферным раствором полоски. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов. Скорость движения белков пропорциональна величине их электрического заряда. За определенное время белковые фракции пройдут различный путь и разделятся.

Схема прибора для электрофореза на бумаге.

Затем белки фиксируют высушиванием и красят красителями. Окрашенные зоны белковых фракций вырезают и элюируют специальным растворителем (растворNaOH) для фотометрического определения каждой фракции. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови получается до 5 фракций: альбумины, ₁-, ₂-, -, -глобулины.

Электрофореграмма сыворотки крови на хроматографической бумаге:

1 – альбумин, 2 – ₁-глобулин, 3 – ₂-глобулин, 4 – -глобулин, 5 – -глобулин.

Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране. Мембрана ацетатцеллюлозы как носитель для электрофореза имеет ряд преимуществ по сравнению с бумагой: однородность, строго определен­ный размер пор, пониженная адсорбционная способность, что исключает образование размытых полос позади зон. Для окрашивания зон применяют методы аналогичные методам окрашивания зон на бумаге.

Электрофорез в гелях. В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агар-агаровый, полиакриламидный гели. Характерной особенностью этой разновидности зонального электрофореза является его высокая разрешающая способность, поскольку гели функционируют как молекулярные сита: крупные молекулы проходят сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле. Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выявляется до 7-8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле – до 20 фракций. Агаровый гель ввиду большого количества воды в нем и вследствие этого большой скорости движения ионов используется в иммуноэлектрофорезе для обнаружения антигенов. Самым перспективным является полиакриламидный гель, так как он прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен, размер пор у этого геля можно варьировать в широких пределах и его можно использовать с самыми различными буферными растворами. Скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе.

Фотография электрофореграмм смеси белков, разделенных в полиакриламидном геле, иллюстрирующая разделение белков по заряду и молекулярной массе.

Вариантов проведения электрофореза в полиакриламидном геле много (вертикальный в трубках и горизонтальный на пластинах).

Схема простейшего прибора для электрофореза в геле

Источник

Электрофорез (ОФС.1.2.1.0021.15). Методика определения

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

Электрофорез (ОФС.1.2.1.0021.15)

Электрофорез – метод анализа, основанный на способности заряженных частиц, растворенных или диспергированных в электролите, перемещаться под действием внешнего электрического поля.

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОФС.1.2.1.0021.15 Электрофорез

Взамен ст. ГФ XI, вып.1

Электрофорез – метод анализа, основанный на способности заряженных частиц, растворенных или диспергированных в электролите, перемещаться под действием внешнего электрического поля.

Различие физико-химических свойств заряженных частиц (размер, форма, величина заряда), а также влияние факторов электролитической среды (напряженность электрического поля, природа среды, вязкость электролита, рН, температура среды, а также продолжительность электрофореза) обусловливают различие скоростей перемещения частиц и, следовательно, обеспечивают их разделение. При электрофорезе на твердых носителях на подвижность и эффективность разделения дополнительное влияние оказывают: адсорбция, неоднородность вещества носителя и его ионообменные свойства, размер пор, электроосмос и капиллярный эффект.

Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для данного вещества. Различают абсолютную и относительную электрофоретическую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность, формирующаяся под влиянием внешнего электрического поля, измеряется в сантиметрах в секунду. Относительная электрофоретическая подвижность представляет собой отношение подвижности исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт.

Все электрофоретические методы могут быть разделены на две основные категории: электрофорез в свободном растворе, называемый также электрофорезом с подвижной границей или фронтальным электрофорезом; и электрофорез на поддерживающих средах, называемый также зональным электрофорезом.

Фронтальный электрофорез

В данном методе воздействию электрического тока подвергается раствор электролита и анализируемые компоненты, помещенные непосредственно в раствор. Этот метод является способом прямого определения электрофоретической подвижности веществ в отсутствие влияния эффектов носителя (адсорбции, электроосмоса, неоднородности среды), однако метод непригоден для выделения чистых компонентов анализируемой смеси из-за низкого разрешения. Метод может применяться для веществ с относительно высокой молекулярной массой, обладающих низкой диффузионной способностью.

Зональный электрофорез

В этом методе используется неподвижный носитель, по поверхности или через объем которого осуществляется миграция ионов, причем стабилизация электролита на плотной матрице позволяет предотвратить конвекцию и смешивание зон после разделения компонентов.

В зависимости от среды и способа проведения зональный электрофорез имеет несколько вариантов. Природа поддерживающей плотной среды (бумага, силикагель, пленки из ацетата целлюлозы, гели на основе крахмала, агарозы, полиамидов или смешанные гели) вносит множество дополнительных факторов, изменяющих подвижность. Если среда не является электрически нейтральной, то в ней на подвижность анализируемых компонентов дополнительное влияние оказывает электроосмотический поток. Например, в капиллярном электрофорезе электроосмотический поток возникает из-за образования двойного слоя между раствором и внутренней стенкой капилляра. Внутренняя стенка плавленого кварца отрицательно заряжена за счет присутствия диссоциированных силанольных групп. Этот отрицательно заряженный слой притягивает положительные ионы из раствора, в результате чего образуется положительно заряженное кольцо жидкости, движущееся в направлении отрицательно заряженного катода.

Электроосмотический поток сильно зависит от рН. Он присутствует только при значениях рН более 4. Чем выше значение рН, тем более четко выражен эффект. Электроосмотический поток может быть уменьшен в результате химической модификации или покрытия внутренней стенки капилляра положительно заряженными амфолитами.

Профиль электроосмотического потока очень плоский по сравнению с гидродинамическим потоком, профиль которого параболический. В результате электроосмотический поток не вызывает размывания пиков.

Разогрев среды, вследствие эффекта Джоуля, может вызывать некоторое испарение жидкости из поддерживающей среды, которое, вследствие капиллярных взаимодействий, вызывает перемещение раствора от краев пластинки к центру.

Следовательно, скорость перемещения зависит от 4 главных факторов: подвижности заряженной частицы, электроосмотического потока, скорости испарения и напряженности поля. Для достижения воспроизводимых результатов необходимо установить и контролировать определенные условия электрофореза (напряжение, температура и т. д.) и использовать реактивы установленной квалификации.

Многообразие методов электрофореза связано с большим количеством разных способов стабилизации электрофоретической среды (градиенты плотности с добавлением глицерина, гликолей, сахарозы, полиаминополикарбоновых кислот), носителей различной природы и разнообразия способов их использования (электрофорез в крахмальном блоке, в тонком слое, на колонке, в пленке или в пластине геля, в трубках или на бумаге).

Влияние различных факторов на электрофоретическую подвижность

Влияние заряда, размера частицы, вязкости электролита и градиента напряжения

Электрофоретическая подвижность заряженной частицы непосредственно связана с величиной заряда и обратно пропорциональна размеру частицы, непосредственно связанному, в свою очередь, с ее молекулярной массой. Поскольку пептиды и другие биологически активные вещества, которые могут быть проанализированы методом электрофореза, обычно не имеют идеальной сферической формы и не подчиняются закону Стокса, то их электрофоретическая подвижность (u₀) лучше всего описывается уравнением:

v – скорость частицы;

E – градиент напряжения, наложенный на электролит;

A – коэффициент формы, обычно в диапазоне от 4 до 6, который показывает обратную зависимость подвижности от квадрата радиуса. В терминах молекулярной массы это подразумевает обратную зависимость подвижности от 2/3 единицы молекулярной массы;

η – вязкость электролита.

Влияние величины рН

Электрофоретическая подвижность зависит от величины рН раствора, влияющей на степень ионизации вещества. В качестве примера на рисунке приведена зависимость подвижности глицина от величины рН.

Рисунок. Зависимость подвижности глицина от величины рН

Значения pK_a 2,2 и 9,9 совпадают с точками перегиба графика. Так как соответствующие функциональные группы на 50 % ионизированы при тех значениях, где pH = pK_a, то электрофоретическая подвижность в этих точках составляет половину от величины, наблюдаемой для полностью ионизированного катиона и аниона, существующего при очень низком и очень высоком значении pH, соответственно. Цвиттер-ион, который существует в промежуточном диапазоне значений pH, электрически нейтрален и имеет нулевую подвижность.

Влияние ионной силы и температуры

Электрофоретическая подвижность уменьшается с увеличением ионной силы применяемого электролита. Ионная сила µ определяется как:

C_i – концентрация иона, моль/л;

Z_i – валентность иона.

Для буферных растворов, в которых и анион, и катион являются одновалентными, ионная сила равна молярности.

Ионная сила электролитов, используемых для электрофореза, обычно выбирается в пределах от 0,01 до 0,10, что зависит от состава образца, так как буферная емкость должна быть достаточно большой, чтобы поддерживалось постоянное значение pH по области расположения зон компонентов.

Температура влияет на подвижность косвенно, так как вязкость η применяемого электролита является величиной, зависимой от температуры. Вязкость воды уменьшается приблизительно на 3 % при изменении температуры на 1 °C в диапазоне температур от 0 до 5 °С и, с меньшей скоростью, в диапазоне комнатных температур. Поэтому подвижность увеличивается с увеличением температуры электролита.

Источник

Процедура электрофореза. Показания и противопоказания.

Под редакцией медицинского консультанта Огородниковой С. В.

Как в медицине, так и в косметологии широко применяется физиопроцедура электрофорез. Она работает с помощью регулируемого гальванического тока, противозаряженные ионы которого переносят через кожу лечебные комплексы, витамины и косметические средства.

Лечебный эффект заключается в одновременном положительном влиянии на организм электрического тока и активных заряженных молекул лекарственного вещества.

Виды электрофореза

Иногда электрофорез называют ионофорезом, но это не совсем верно: да, обе процедуры работают на гальваническом токе, однако, все дело в его количестве. При ионофорезе разряд совсем слабый и постоянный, а электрофорез предполагает его увеличение во время сеанса.

На этом отличия не заканчиваются. При ионофорезе два противоположно заряженных электрода располагаются в пропитанной физическим раствором прокладке рядом друг с другом. При гальваническом электрофорезе один электрод находится на проблемном участке тела пациента, а противоположно заряженный электрод человек держит в руке (или электрод закрепляется на теле, зависит от вида процедуры).

Далее подробнее осветим способ гальванического электрофореза, так как именно его чаще всего используют как в медицине, так и в косметологии.

Описание процедуры

Когда электрический ток сочетают с лекарственными веществами, образуются ионы 一 положительно заряженные частицы «+». Они попадают вглубь тканей до 5 мм и заодно переносят оздоровительный комплекс через кожу в клетки организма.

Неотъемлемая часть электрофореза 一 это катод и анод 一 разнозаряженные электроды, которые создают электрическое поле. Один из них помещается на проблемный участок на теле пациента, другой зажимается в руке или закрепляется на участке тела согласно схеме, которая прилагается к аппарату.

В зависимости от эффекта, который ожидается от электрофореза, на проблемную зону помещается либо анод, или катод:

Как влияют процедуры с анодом или катодом на организм подробнее показано в таблице:

Воздействие разнозаряженных электродов на организм во время сеанса гальванического электрофореза

Электрофорез можно проводить в клинике, так и самостоятельно дома при помощи специальных аппаратов. В данной процедуре ничего сложного, достаточно быть просто внимательным: не путать катод (отрицательный электрод) и анод (положительный). Для этого нужно подробно изучить инструкцию по применению.

Также не все лечебные препараты подходят под электрофорез 一 только «заряженные» средства, а об этом должна сообщить соответствующая маркировка на упаковке препарата.

Кому и для чего нужен электрофорез

Физиотерапия используется как в медицине, так и в косметологии. Но в каких случаях выбирают тот или иной способ? Электрофорез поможет решить такие проблемы в косметологии как:

В медицине электрофорез используется гораздо шире, тому доказательство 一 следующие показания к применению:

Перед тем, как начать делать процедуры электрофореза, в любом случае необходимо проконсультироваться с врачом. Он назначит необходимое время сеанса (обычно это от 10 до 20 минут), нужную концентрацию раствора и подберет лекарство. Также, если вы принимаете какие-либо препараты или делаете другие физиотерапевтические процедуры, стоит об этом предупредить. Очень важно не перегружать организм, особенно детский. Электрофорез для детей должен длиться не более 10-15 минут в день, для взрослых 一 не более 25 минут.

Противопоказания к применению электрофореза

Как и у любого другого способа физиотерапии или препарата, у электрофореза есть свои противопоказания, о которых необходимо знать:

Побочные эффекты возникают редко, однако они есть. Это может быть покраснение, зуд или отек на месте электрода при аллергии на лекарство или реакции на электрический ток. На 2-3 сеансе возможно повышение температуры и болезненных ощущений при воспалительных заболеваниях, но после окончания курса они исчезают сами.

Совмещение электрофореза с Ферменколом

Для проведения домашних процедур электрофореза подойдут аппараты Элфор, Элфор-Плюс, Элфор-Про и Невотон. Ферменкол показан в качестве косметического средства для сеанса электрофореза при:

Ферменкол 一 положительно заряженное средство, то есть проникать в поврежденную ткань он должен через анод.

Для коррекции гипертрофических и келоидных рубцов предназначен Ферменкол набор для энзимной коррекции из линейки этой продукции. В него входят:

Во время процедуры электрофореза частицы Ферменкола проникают под кожу и избирательно воздействуют на рубцовую ткань: действие раствора происходит лишь на поврежденной ткани, разрушая «плохие» клетки 一 избыточный коллаген и гиалуроновую кислоту. Все частицы от разрушенных клеток выводятся из организма естественным путем или используются для строительства здоровых клеток.

Электрофорез с Ферменколом — эффективный метод введения ферментов коллагеназы в глубоко расположенные участки рубцовой ткани при помощи постоянного электрического напряжения.

Благодаря электрофорезу с Ферменколом рубцы бледнеют, уменьшаются в размерах, становятся менее плотными и более эластичными, снижается или прекращается зуд, нормализуется гидратация рубцовой ткани.

Первые положительные результаты заметны уже через 2-3 процедуры электрофореза с Ферменколом.

Чтобы получить подробные рекомендации по коррекции рубцов и растяжек, обратитесь к специалисту. Консультация бесплатная, от вас потребуется только фотография проблемной зоны и описание того, что вас беспокоит.

Всю продукцию Ферменкол, а также упомянутые аппараты для физиотерапии вы можете приобрести в нашем интернет-магазине или в ближайшей аптеке.

Источник

Электрофорез

Электрокинетические явления

Влияние природы дисперсионной среды

Влияние рН среды

Дисперсионная среда обычно характеризуется двумя величинами: диэлектрической проницаемостью e и вязкостью m.

z-потенциал частиц золя тем больше, чем больше e (полярность растворителя).

Чем больше вязкость, тем толще слой дисперсионной среды, который прилипает к частице при разрыве мицеллы и, следовательно, тем меньше численное значение z-потенциала.

Электрокинетические явления – это явления, которые возникают при воздействии электрического поля на дисперсную систему (электрофорез, электроосмос), а также в результате перемещения частиц дисперсной фазы или дисперсионной среды (потенциал протекания, потенциал оседания).

Несмотря на различие электрокинетических явлений, все они связаны с наличием ДЭС на частицах дисперсной фазы. Интенсивность всех электрокинетических явлений определяется значением z-потенциала.

Электрофорез – направленное движение частиц дисперсной фазы относительно дисперсионной среды под действием внешнего электрического поля.

При наложении внешнего электрического поля происходит разрыв мицеллы: частицы дисперсной фазы вместе с адсорбированными на них потенциалопределяющими ионами и противоионами адсорбционного слоя перемещаются к электроду, знак которого противоположен знаку заряда коллоидной частицы (z-потенциалу), а противоионы диффузионного слоя – к другому электроду. Например, если дисперсная фаза заряжена отрицательно, коллоидные частицы движутся к аноду (положительному электроду), а положительно заряженные противоионы диффузного слоя – к катоду (рис. 32).

Если дисперсная фаза заряжена положительно, направление движения частиц меняется на противоположное.

Скорость движения, или электрофоретическая скорость, зависит от величины электрокинетического потенциала z, напряженности электрического поля E/L и свойств сплошной среды – динамической вязкости μ и диэлектрической проницаемости e:

,

Коэффициент y учитывает форму частиц и их ориентацию в электрическом поле. Для шарообразных частиц коэффициент y равен 0,66, а для цилиндрических, ориентированных вдоль силовых линий электрического поля – 1.

Скорость движения в расчете на единицу напряженности электрического поля Н называется электрофоретической подвижностью

.

Электрофоретическая подвижность зависит только от свойств дисперсной фазы и дисперсионной среды.

На подвижность коллоидной частицы оказывают влияние электрофоретический и релаксационный эффекты.

Электрофоретический эффект (эффект торможения): под действием внешнего электрического поля противоионы передвигаются в направлении, противоположном движению частицы. За счет гидратации противоионы увлекают за собой и окружающую их жидкость (дисперсионную среду). Это приводит к тому, что частица перемещаются в направлении, противоположном движению жидкости, скорость ее уменьшается.

Релаксационный эффект вызывается нарушением симметрии ДЭС вокруг частицы при ее движении. ДЭС деформируется и отстает от частицы. В результате возникает добавочное электрическое поле, которое действует на частицу, стремясь двигать ее в обратном направлении, и тем самым влияет на скорость электрофореза.

Для учета влияния этих факторов в уравнение для расчета электрофоретической скорости и вводится коэффициент y.

Источник