какие требования предъявляются к составу питательных сред
Какие требования предъявляются к составу питательных сред
от 27 марта 2009 года N 01И-170/09
Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития, в связи с обращениями организаций и учреждений, доводит до вашего сведения Методические рекомендации по классификации питательных сред для медицинской микробиологии (лабораторная диагностика in vitro) в целях регистрации изделий медицинского назначения, разработанные Рабочей группой по сопровождению внедрения административных регламентов Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития по исполнению государственных функций в сфере обращения изделий медицинского назначения, осуществляющей свою деятельность в соответствии с приказом Росздравнадзора от 27.04.2007 N 785-Пр/07 «О создании рабочей группы по сопровождению внедрения административных регламентов Росздравнадзора по исполнению государственных функций в сфере обращения изделий медицинского назначения».
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы по
надзору в сфере здравоохранения
Н.В.Юргель
26 марта 2009 года
Методические рекомендации
«Классификация питательных сред для медицинской микробиологии (лабораторная диагностика in vitro) в целях регистрации изделий медицинского назначения»
В XX веке проблема микробиологических сред получает новое развитие. Внедрение противомикробных лекарственных препаратов, в первую очередь антибиотиков, потребовало широкой гаммы питательных сред для культивирования продуцентов, определения антибиотических веществ в ферментационных жидкостях, субстанциях, лекарственных формах и биологических субстратах, а так же для определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам.
С особой остротой была поставлена задача стандартизации питательных сред, многие из которых содержат плохо стандартизируемые компоненты. В этой связи все большее развитие получают многокомпонентные синтетические среды. На сегодняшний день все больше появляется питательных сред, содержащих стандартные компоненты, что позволяет контролировать качество сред, а так же качественность проводимых с их использованием исследований.
В соответствии с требованиями Административного регламента Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития по исполнению государственной функции по регистрации изделий медицинского назначения, утвержденного приказом Минздравсоцразвития России от 30.10.2006 N 735, регистрация Минюста России от 30.11.2006 N 8542, регистрации подлежат изделия, предполагаемые к использованию в медицинских целях, в том числе диагностики. Таким образом, питательные среды, использующиеся в лабораторной диагностике, подлежат регистрации в Росздравнадзоре. В целях гармонизации процесса регистрации Росздравнадзором предложено использование классификации питательных сред по составу, назначению и консистенции с учетом требований клинической лабораторной практики.
Классификация питательных сред
I. По составу различают:
2. Полусинтетические среды, в состав которых наряду с веществами неопределенного состава входят соединения известной химической природы.
II. По назначению различают:
2. Специальные элективные (избирательные) среды применяются для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или получения накопительных культур. Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов, что достигается путем создания оптимальных условий для развития для одних микроорганизмов, т.е. положительной селекцией, или угнетением роста других, т.е. методом отрицательной селекции.
III. По консистенции различают:
При регистрации питательных сред должна использоваться классификация по трем критериям (состав, назначение и консистенция) для определения номенклатуры питательных сред, а так же классификация в зависимости от степени потенциального риска применения. Питательные среды, имеющие одинаковый состав, назначение и консистенцию (все критерии) могут быть объединены в группы. Регистрация питательных сред, в том числе объединенных в группы, осуществляется Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на основании результатов соответствующих испытаний и оценок, подтверждающих качество, эффективность и безопасность для каждой питательной среды в объеме, определенном пунктом 1.7 вышеназванного регламента.
Список литературы:
Электронный текст документа
подготовлен ЗАО «Кодекс» и сверен по:
Какие требования предъявляются к составу питательных сред
1. Основные принципы и условия культивирования бактерий. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам. Особенности культивирования грибов и простейших.
Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды, необходимых для их жизнедеятельности. В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах.
Условия культивирования микроорганизмов
Для роста микроорганизмов существенное значение имеет состав питательной среды, кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.
Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода (группа облигатных аэробов). Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода (облигатные анаэробы). Существует также переходные группы микроорганизмов по потребности в кислороде.
Для выращивания аэробных форм микроорганизмов чаще всего используется метод поверхностного культивирования на плотных и жидких питательных средах. Питательные среды разливают тонким слоем в посуду с широким дном, обычно в чашки Петри. Для получения аэробного роста в большом объеме жидкой среды требуется дополнительная аэрация. Для этого используются различные устройства, обеспечивающие постоянное перемешивание среды путем встряхивания или вращения сосудов. Можно пропускать стерилизованный воздух через жидкость под давлением с помощью пористых разбрызгивателей или обеспечивать механическое перемешивание специальными механизмами.
Для роста строго анаэробных микроорганизмов нужно исключить попадание кислорода в среду инкубации. Для этого среды перед посевом кипятят, посевы выдерживают в герметически закрытых сосудах или в специальных вакуумных анаэростатах, из которых с помощью насосов выкачивается воздух, или воздух в них заменяется каким-нибудь инертным газом (например, азотом). В анаэростат можно добавлять различные вещества, поглощающие кислород – щелочной пирогаллол, хлорид одновалентной меди и др. Кроме того используют разные приёмы: выращивание в высоком слое среды; культивирование в вязких средах; выращивание в толще плотной среды.
При культивировании автотрофных микроорганизмов, использующих в качестве источника углерода углекислый газ, добавляют в среду NaHCO3.
Температура. Интервал температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируется. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам микроорганизмов, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37ºС. У термофилов он значительно выше: от 45 до 80–90ºС. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5–10ºС. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая температура. Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.
Вода. Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причём вода должна находиться в доступной для клетки форме, то есть в жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворённых веществ и не может быть использована микроорганизмами. Различную активность воды в питательной среде создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, KCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль.
Пищевые потребности микроорганизмов и требования
к питательным средам:
Для выделения, выращивания и длительного сохранения микроорганизмов в культурах используют различные питательные среды, содержащие все вещества, необходимые для их роста. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Однако выделяют основные группы необходимых питательных веществ.
1. Источники углерода. По потребности в углероде микроорганизмы принято делить на автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислый газ. Для культивирования автотрофов в среды вносят бикарбонат натрия или карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, обогащённый 1–5 % углекислого газа. Для культивирования гетеротрофов среда должна содержать органические вещества – кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения.
2. Источники азота. Потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями. Для очень многих микробов это могут быть неорганические соединения – соли аммония, нитраты. Потребности других микроорганизмов в азоте удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка или аминокислоты. Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления – пептоны, представляющие собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотистых оснований, солей и микроэлементов. Пептоны получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного или растительного происхождения.
3. Минеральные соли. Микроорганизмам для построения веществ клетки кроме углерода и азота необходимы также сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в среде в доступной форме. Потребности в этих элементах обычно удовлетворяются за счёт минеральных солей – сульфатов, фосфатов и хлоридов магния, кальция, натрия, железа и др.
4. Микроэлементы. Потребности микроорганизмов в микроэлементах (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт) очень малы. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред микроэлементы необходимо дополнительно вносить.
5. Факторы роста. Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания. Чтобы подчеркнуть потребность микробов в факторах роста, принято использовать термины прототрофы и ауксотрофы. Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или несколько факторов роста. Примерами смесей, содержащих различные факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт.
Существует ряд требований, предъявляемых к питательным средам:
1. среды должны содержать полный набор необходимых питательных веществ;
2. среды должны быть изотоничными (для большинства микроорганиз-мов концентрация солей не должна превышать 0,5 %);
3. кислотность среды должна быть нейтральной или слабощелочной (pН=6–8). В процессе культивирования микроорганизмов в среду могут выделяться метаболиты, изменяющие рН среды настолько, что рост микроорганизмов существенно замедляется или даже становится невозможным. Чтобы избежать изменения рН, в среду добавляют буферные системы, чаще фосфатные (они малотоксичны для микроорганизмов и используются ими также в качестве источника фосфора);
Какие требования предъявляются к составу питательных сред
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Методы контроля бактериологических питательных сред
Дата введения: с момента утверждения
1. Разработаны: Федеральным государственным учреждением науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.М.Суханова, Н.Е.Захарова, Э.И.Конду, И.А.Голубенко).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).
3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 18 января 2008 г.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания предназначены для работников организаций, осуществляющих:
изготовление и контроль качества бактериологических питательных сред (диагностических, для культивирования, транспортных и др.) и (или) их основ при серийном промышленном выпуске;
конструирование новых питательных сред;
изготовление сред из отдельных компонентов по прописям, а также могут быть использованы:
— при экспертизе НД и
— при проведении внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред.
1.2. Настоящие методические указания распространяются на исследования бактериологических питательных сред отечественного и зарубежного производства.
2. Нормативные и методические ссылки
2.1. Государственная Фармакопея СССР XI издания. Вып.1, 2.
2.4. Санитарные правила СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности» /Госкомсанэпиднадзор России. М., 1996.
2.5. Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований: ГОСТ Р 51446-99 (ISO 7218-96).
2.6. Агар микробиологический: ГОСТ 17206-96.
2.7. Методические рекомендации «Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом «Ускоренного старения» при повышенной температуре». Махачкала, 1987.
2.8. Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки: ГОСТ 26185-84.
2.9. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980.
2.10. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.
2.11. Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»: МУК 4.2.1890-04.
3. Общие положения
3.1. Целью введения настоящих методических указаний является регламентация стандартных методов контроля бактериологических питательных сред.
3.2. Методические указания содержат описание общих методов контроля бактериологических питательных сред. Особенности контроля качества сред, не охватываемые настоящим документом, должны быть описаны в нормативной документации на эти препараты.
4. Термины и определения
4.5. Оценка результатов. Определение положительного или отрицательного результата.
5. Общие указания при оценке качества питательных сред
I. Оценка качества питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей, выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением, и включает:*
1. Контроль качества препарата по физико-химическим показателям.
* Используемые в лабораториях коммерческие питательные среды контролируются на предприятиях-изготовителях, поэтому внутрилабораторный контроль их качества проводят только в случаях:
указания на необходимость проведения контроля в приказах Минздрава РФ, инструкции по применению или других документах;
несоответствия клинического диагноза результатам микробиологического исследования в лаборатории;
неудовлетворительного выполнения внешней оценки качества микробиологических исследований;
неудовлетворительного качества среды при использовании в практической работе;
несоответствия величины колоний искомого микроорганизма данному виду бактерий при росте в данной среде;
позднего появления роста культуры в среде, не соответствующего срокам для данного микроорганизма;
отсутствия подавления роста сопутствующей микрофлоры на среде с заявленными ингибирующими свойствами.
Для внутрилабораторного контроля качества коммерческих питательных сред, контроль которых не предусмотрен действующими нормативными документами, необходимо проводить визуальную оценку качества, определять значение рН готовой среды, стерильность каждой приготовленной серии (см. р.7.1.1 «Контроль чистоты розлива»), а также оценивать качество среды с помощью контрольных штаммов.
2. Контроль специфической активности препарата по биологическим показателям.
Перечень показателей, необходимых для контроля основных групп питательных сред, приведен в прилож.1.
Готовую среду засевают культурой (тест-штаммом) того (целевого) микроорганизма, для которого приготовлена среда, и гетерологичных штаммов и визуально (или под малым увеличением микроскопа) изучают характер его роста. Рост микроорганизмов оценивают с помощью количественных (для плотных сред), полуколичественных или качественных методов*.
Для оценки результатов качественным методом определяют наличие и характер роста каждого из тест-штаммов. Рост целевых тест-штаммов должен быть типичным по цвету, размеру и морфологии колоний; рост нецелевых должен частично или полностью подавляться.
Для оценки результатов количественным методом при интерпретации ингибирующих, накопительных или задерживающих рост свойств среды, подсчитывают количество выросших колоний на тестируемой и контрольной (среде выращивания) средах.
Требования к специфической активности зарегистрированных в РФ бактериологических питательных сред и добавок перечислены в прилож.2.
III. Серия среды признается годной только после проведения всех видов контроля.
6. Определение физико-химических показателей
6.1. Общие указания для приготовления реактивов
Концентрация. При указании концентрации растворов в процентах, следует подразумевать весобъемные проценты. Например, для приготовления 10%-го раствора следует брать 10 г вещества на 100 мл готового раствора.
Точная навеска. Взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,0002 г. Если не указано «точная навеска», то навеску берут с точностью до 0,01 г.
Оценка результатов. Результаты рассчитывают на основании не менее двух параллельных определений. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое значений результатов двух параллельных измерений. Допустимое отклонение от средней величины не должно превышать 10%.
Реактивы и титрованные растворы. Реактивы и титрованные растворы, приведенные в настоящих МУК, описаны в соответствующих разделах Государственной Фармакопеи СССР XI издания, вып.2, если нет других указаний.
Квалификация реактивов. Для анализа необходимо использовать реактивы квалификации хч и чда.
Хранение реактивов. Растворы реактивов хранят при температуре 18-20 °С в течение 6 мес., если нет изменений их физических свойств или нет других указаний.
Контрольный опыт (контроль на реактивы). Под контрольным опытом подразумевают определение, проводимое с тем же количеством реактивов и в тех же условиях, но без испытуемого препарата, вместо которого используют растворитель.
6.2. Описание препарата
Внешний вид препарата определяют визуально, указывая:
физическое состояние (жидкость, мелкодисперсный порошок, гель);
прозрачность (для препаратов готовых к применению). Препарат может быть либо прозрачным, либо с незначительной опалесценцией, либо мутный);
гигроскопичность (для сухих препаратов);
светочувствительность (при наличии в составе компонентов, разрушающихся на свету.
* При описании цвета оттенок указывают перед основным цветом (например, «желтовато-коричневый»).
6.3. Определение растворимости
Количество препарата (г), необходимое для приготовления конкретной серии питательной среды, должно растворяться при перемешивании и, если необходимо, при кипячении в течение 2-3 мин.
Препарат считают растворившимся, если в растворе при визуальном наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества.
Для препаратов, образующих при растворении мутные растворы, соответствующее указание должно быть приведено в нормативной документации и инструкции по применению.
Питательные среды, требования к ним.
Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные условия для жизнедеятельности микробов.
Требования, предъявляемые к питательным средам
1) содержать все необходимые питательные вещества (микроэлементы, витамины, некоторые аминокислоты);
3) быть изотоничными для микробной клетки, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида;
4) быть стерильными: посторонние микроорганизмы препятствуют росту изучаемого м/о, определению его свойств и изменяют свойство среды;
5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию;
В настоящее время предложено огромное количество сред, в основу классификации которых положены следующие признаки:
1. Исходные компоненты: различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения.
Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен, поэтому эти среды легко воспроизводимы.
2. Консистенция (степень плотности): Среды бывают жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких веществ, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин.
3. Состав: среды делят на простые и сложные. К первым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.
а) основные (МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода);
б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах.
в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов (соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа). Жидкие элективные среды называют средами накопления (пептонная вода с рН 8,0) в ней активно размножается холерный вибрион, а другие бактерии не растут;
г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности (среды Гисса с углеводами и индикатором, Эндо, Левина, Плоскирева). При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды;
Дата добавления: 2016-05-25 ; просмотров: 9689 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
Классификация питательных сред: микробиология
Питательные среды и требования к ним
Микробиологическое исследование — это выделение чистых культур микроорганизмов, культивирование и изучение их свойств.
Для культивирования микроорганизмов необходимы особые субстраты — питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются).
Питательные среды
Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные условия для жизнедеятельности микробов.
Требования, предъявляемые к питательным средам
1) содержать все необходимые питательные вещества (микроэлементы, витамины, некоторые аминокислоты);
2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов — рН (для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2—7,4), исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,5—9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2—6,8);
3) быть изотоничными для микробной клетки, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида;
4) быть стерильными: посторонние микроорганизмы препятствуют росту изучаемого м/о, определению его свойств и изменяют свойство среды;
5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию;
Желательно, чтобы среды были прозрачными — удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.
Классификация сред
В настоящее время предложено огромное количество сред, в основу классификации которых положены следующие признаки:
1. Исходные компоненты: различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения.
Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен, поэтому эти среды легко воспроизводимы.
2. Консистенция (степень плотности): Среды бывают жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких веществ, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин.
Агар-агар — полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Он не является для микроорганизмов питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В воде агар-агар плавиться при 80-100С, застывает 40-45С.
3. Состав: среды делят на простые и сложные. К первым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.
а) основные (МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода);
б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах.
Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков — сыворотку крови, для возбудителя коклюша — кровь;
в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов (соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа). Жидкие элективные среды называют средами накопления (пептонная вода с рН 8,0) в ней активно размножается холерный вибрион, а другие бактерии не растут;
г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности (среды Гисса с углеводами и индикатором, Эндо, Левина, Плоскирева). При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды;
д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды — глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий.
Классификация питательных сред
При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.
Классификация питательных сред по составу
1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Существует несколько способов приготовления МПБ:
а) на мясной воде с добавлением готового пептона;
б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.
Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путем добавления arap-arapa (l,5-3%)к МПБ.
Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.
2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)
Классификация питательных сред по исходным компонентам
1.Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.
2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки.
Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.
3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды получают полусинтетические среды.
Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полужидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые – 1,5-2,5%).
Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена.
Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.
Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.
Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов.К этой группе относятся: МПБ – мясо-пептонный бульон, МПА — мясо-пептонный агар, МПЖ – мясо-пептонный желатин и т.п.
Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.
Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.
1.Среды обогащения.Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон).Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека.
Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.
2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов.
При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.
Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Eh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NaCl, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией.
К этой группе относятся:
Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.
Висмут-сульфит агар – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень.
Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.
Желточно-солевой агар (ЖСА) –среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки.
Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».
Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.
Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.
3.Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.
Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором BP). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа.
Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды.
Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу. Такой средой является среда Эндо.
Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет.
Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они не сбраживают лактозу.
4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.
5.Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Этисреды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.
Стерилизация питательных сред
Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют.
Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.
1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С и давлении 1-1,5 атмосферы.
2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.
Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.
4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.
Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут.
Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, производят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких образцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.
Существует также биологический контроль сред.
В этом случае несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.
Асептика и антисептика
Асептика — комплекс профилактических мероприятий, направленных на предотвращение попадания микроорганизмов в какой-либо объект: рану, операционное поле, стерильный раствор или лекарственный препарат.
1) стерилизацию инструментов, приборов, материалов;
2) специальную (антисептическую) обработку рук перед асептичной работой;
3) соблюдение определенных правил и приёмов работы (стерильный халат, маска, перчатки, исключение разговоров и т.п.);
4) осуществление специальных санитарно-противоэпидемических и гигиенических мероприятий (правильная вентиляция, влажная уборка с применением дезинфицирующих средств, использование бактерицидных облучателей, боксированных помещений).
Антисептика — это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микробов, попавших в рану, лекарственный препарат или другой объект.
1) механическую (например, при обработке раны удаление из нее инфицированных и нежизнеспособных тканей, инородных тел);
2) физическую (наложение гигроскопических повязок, дренирование ран, применение гипертонических растворов, способствующих оттоку раневого отделяемого в повязку, сухого тепла, УФО, лазера);
3) химическую (применяют химические вещества, обладающие бактерицидными или бактериостатическим действием при минимальном органотропном действии, например, этиловый спирт, перекись водорода, мирамистин или хлоргексидин; в лекарственные препараты вносят борную кислоту, мертиолят и др.);
4) биологическую (использование протеолитических ферментов для лизиса нежизнеспособных клеток, применение антибиотиков, бактериофагов, иммуноглобулинов, средств, стимулирующих защитные силы организма).