Синтез рнк как называется
Синтез рнк как называется
Большинство процессов метаболизма в организме катализируются белковыми ферментами. Кроме того, белки — основные структурные компоненты тела человека. Аминокислотные последовательности всех белков зашифрованы в ДНК, а процесс превращения закодированной информации в сам белок включает её транскрипцию на гяРНК, процессинг на иРНК, трансляцию на полипептид и окончательную сборку белка.
Строение гена
В отличие от прокариот у эукариот большинство генов имеют участок ДНК, который прерывает кодирующую последовательность. Данные некодирующие фрагменты называют нитронами, в то время как другие, кодирующие участки— экзонами. У обеих групп после кодирующего участка присутствуют лидерная и трейлерная последовательности, а также ряд последовательностей, контролирующих процесс транскрипции.
Гены, которые кодируют белок, называют «структурными генами», их транскрипция происходит при участии РНК-полимеразы II. Участок, расположенный непосредственно перед кодирующей последовательностью (в направлении от 3′- к 5′-концу), называют промотором. Он служит для связывания с факторами транскрипции, которые указывают, где РНКаза II должна начать своё действие.
Среди белков различают белки «домашнего хозяйства», которые присутствуют во всех клетках организма, а также белки «роскоши», осуществляющие специальные функции. В состав промоторов генов, кодирующих белки «роскоши», входит «бокс TATA», имеющий последовательность наподобие 5′-ТАТААА-3′, повторяющуюся на протяжении примерно 25 пар нуклеотидов и предшествующую участку начала транскрипции.
Гены, кодирующие белки «домашнего хозяйства», имеют на подобных участках один или несколько «боксов ГЦ», составляющих последовательность наподобие 5′-ГГГГДТГ-3. Другой распространённый промоторный участок— «бокс ЦААТ» (например, 5′-ЦЦААТ-3′) длиной до 80 пар нуклеотидов, имеющий энхансерные и сайленсерные последовательности на некотором расстоянии от него, которые связывают факторы контроля, взаимодействующие с промотором, образуя петлю ДНК.
Некоторые гены «роскоши» также имеют дополнительные специфические факторы контроля.
Фрагмент, расположенный ниже участка начала транскрипции (5’—3′), называют лидерной последовательностью, он не транслируется. Затем следует кодирующий участок, обычно прерываемый одним или несколькими интронами, а после — некодирующий трейлерный (концевой) участок, на конце которого участок полиаденилирования (поли-А-сайт), имеющий вариабельную последовательность наподобие 5′-ААТАА-3′ (5′-ААУАА-3′ на РНК-транскрипте) длиной 10-30 пар нуклеотидов в направлении 3’—5′.
Интроны начинаются последовательностью ГТА(/Г)ГАГТ и заканчиваются серией из Ц- или Т-оснований, предшествующих АГ. Для удаления интрона значение имеют первые основания Г и Т (Г и У в гяРНК) и последние АГ, а также остаток аденина в составе последовательности ближе к 5′-концу. Участок, находящийся ближе к 5′-концу, известен под названием донор, ближе к З’-концу — акцептор, а остаток аденина называют участком ветви.
У прокариот транскрипция останавливается на особом участке, состоящем из инвертированного повтора трейлера и ряда Т-остатков. К прекращению транскрипции приводит появление петли-«шпильки», образованной путём спаривания оснований в копии иРНК. Подобная структура существует и в трейлерах гистонных генов. У эукариот не обнаружено общего сигнального участка терминации транскрипции.
Транскрипция при синтезе иРНК
Сигналом к началу транскрипции служит комплекс белков-факторов транскрипции, находящийся в промоторе. Молекула РНКазы II связывается с данным транскрипционным комплексом и разрывает двойную спираль. После этого комплекс, уже имеющий в своём составе фермент, движется подобно «застёжке на молнии» в направлении 5’—3′, вызывая разматывание и разделение цепи в месте, где он проходит, а затем восстанавливая структуру двойной спирали сразу после прохождения участка.
Таким образом формируется транскрипционное вздутие. Как только он достигает участка начала транскрипции, происходит отщепление одного из факторов транскрипции и присоединение другого, после чего начинается процесс синтеза РНК.
Используя в качестве матрицы цепь в направлении 3’—5′ (слева направо), РНКаза II поочерёдно захватывает рибонуклеотиды и соединяет их друг с другом, образуя комплементарную последовательность РНК, ориентированную в обратном направлении (то есть от 5′ к 3′).
Другими словами, используя правила комплементарного спаривания оснований при взаимодействии с матричной цепью, РНКаза создаёт точную РНК-копию кодирующей цепи. Фермент транскрибирует лидерный и трейлерный участки, экзоны, интроны и (по всей видимости, напрасно) продвигается дальше в направлении 5’—3′.
Факторы транскрипции при синтезе иРНК
Факторы транскрипции — белки, прикрепляющиеся к промоторной последовательности и запускающие процесс транскрипции. В их состав обычно входят активационный домен и ДНК-связывающий домен. Активационные домены богаты глутаматом, а также аспартатом или пролином, которые облегчают формирование транскрипционного комплекса. Кроме того, различают четыре типа ДНК-связывающих доменов.
• Лейциновая «молния» представляет собой а-спираль, состоящую из аминокислотных остатков, каждый седьмой из которых представлен лейцином, что в свою очередь соответствует каждому второму повороту двойной цепи ДНК. Это позволяет парам оснований сцепляться и образовывать расходящийся участок на конце, который предположительно сжимает нить ДНК наподобие прищепки.
• Спираль-петля-спираль состоит из двух белковых а-спиралей, которые соединены длинной, гибкой петлёй, позволяющей параллельно упаковывать их близко друг к другу. Считают, что данная структура осуществляет контроль процесса транскрипции путём блокирования других регуляторных белков гена.
• Спираль-поворот-спираль состоит из двух коротких а-спиралей, разделённых аминокислотной последовательностью, слишком короткой, чтобы позволить им лежать в одной плоскости. Этот фрагмент — характерный признак гомеобокса (см. главу 12).
• Цинковый палец — структура, напоминающая по строению палец, включающая около 23 аминокислот, удерживаемых четырёхвалентным ионом цинка, который находится в основании «пальца» и обычно связан с четырьмя основаниями цистеина либо двумя — цистеина, двумя — гистидина.
Процессинг РНК
Для того чтобы только что синтезированные гяРНК стали кодирующими матрицами для последующей трансляции и образования полипептидов, они претерпевают ковалентное видоизменение. При этом вначале к 5′-концу в обратном направлении прикрепляется 7-метил-ГТФ (кэп). Как только на цепи гяРНК возникает участок полиаденилирования, она в этом месте расщепляется, а затем при помощи полиА-полимеразы происходит присоединение 100—200 остатков адениловой кислоты и таким образом формируется поли-А-хвост (полнаденильный хвост).
Наряду с кэпом поли-А-хвост предположительно защищает молекулу от разрушения экзонуклеазами, служит так называемым паспортом, необходимым для её попадания в цитоплазму, а позже становится сигнальным участком для рибосомы, указывающим на возможность начала трансляции.
Молекула гяРНК в среднем содержит около 7000 нуклеотидов, количество которых в иРНК сокращается до 1200 путём удаления примерно 50 интронов. Характерная особенность гистонных генов — отсутствие интронов.
Иногда в некоторых транскриптах (особенно при производстве антител) обнаруживают альтернативные механизмы сплайсинга, однако ошибки в данном процессе играют важную роль в развитии многих генетических заболеваний. Так, церебральный паралич и задержка умственного развития при синдроме Жильбера обусловлены внедрением Т—А в нормальную последовательность ТАТАА промотора гена УДФ-гликозилтрансферазы. А-аманитин, содержащийся в бледной поганке (Amanita phalloides), блокирует действие РНКазы II.
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
Параграф 80. рнк синтез транскрипция
Автор текста – Анисимова Елена Сергеевна.
Авторские права защищены. Продавать текст нельзя.
Курсив НЕ НУЖНО зубрить.
Замечания и отзывы можно прислать по электронной почте: exam_bch@mail.ru
https://vk.com/bch_5
ПАРАГРАФ 80:
«РНК: синтез (транскрипция), сплайсинг, обратная транскрипция»
См. сначала п.70, 73 и 74, 77, 79, можно 78 и 76.
Содержание параграфа 80:
80. 1. Транскрипция, ее отличия от репликации.
80. 2. Процессинг про-РНК.
Сплайсинг про-РНК.
Рибозимы.
Нарушения сплайсинга.
Альтернативный сплайсинг.
80. 3. Обратная транскрипция. См. п.79, 86.
Интеграция в генОм.
Амплификация.
80. 4. «Мир РНК».
РНК – это цепь из (рибо)нуклеотидов.
Точнее – это полимер из нуклеотидных остатков в качестве мономеров.
Функции РНК:
набор разных РНК позволяет синтезировать белки, закодированные в ДНК.
Кроме этого, есть регуляторные РНК.
80. 1. Транскрипция, ее отличия от репликации. п.70, 73, 77 и 78.
Определение. Транскрипция («считывание») – это синтез РНК на матрице ДНК.
Синтез РНК на матрице РНК тоже бывает, он называется репликацией РНК (см. п.77) и обнаружен только у вирусов.
Синтез РНК похож на синтез ДНК при репликации, но есть и отличия:
1. Матрица.
При репликации в качестве матриц используются обе цепи ДНК полностью
(кроме концов ДНК – см. теломеры в п.78),
При транскрипции в качестве матрицы используется тоже ДНК,
но не вся, а только участок одной из цепей дуплекса –
это транскрибируемый участок ДНК, использующийся в качестве матрицы при транскрипции, называется гЕном.
2. Субстраты.
ДНК синтезируется из дезоксирибонуклеотидов (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТК),
а РНК – из рибонуклеотидов (из АТФ, ГТФ, УТФ и ЦТФ).
3. Основной фермент
синтеза ДНК (присоединяющий новые нуклеотиды) – ДНК-полимераза (см. п.78),
а основной фермент синтеза РНК (транскрипции) – РНК-полимераза.
4. Праймер:
При синтезе РНК не нужно образовывать праймер (РНК-затравку),
а при синтезе ДНК (при репликации) нужно образовывать праймер (затравку из РНК).
Чтобы ДНК стала матрицей при транскрипции,
перед транскрипцией цепи ДНК должны отделиться друг от друга
(не по всей длине ДНК, а только в том участке, где происходит транскрипция).
После разделения цепей дуплекса одна из цепей дуплекса используется в качестве матрицы при синтезе РНК (при транскрипции).
Начало синтеза РНК (транскрипции) называется ИНИЦИАЦИЕЙ транскрипции.
К определённому нуклеотиду ДНК присоединяется первый нуклеотид РНК
(тот из четырёх рибонуклеотидов, который комплементарен этому нуклеотиду ДНК-матрицы;
связывание нуклеотидов происходит через азотистые основания, водородными связями – см. п.78 и 77),
то есть к азотистому основанию нуклеотида матрицы
водородными связями присоединяется комплементарное основанию
азотистое основание нуклеотида РНК.
Затем ко второму нуклеотиду матрицы так же присоединяется
второй нуклеотид РНК (комплементарный второму нуклеотиду матрицы).
После этого два фосфата от второго нуклеотида отщепляются,
а за счёт выделяющийся при этом энергии
второй рибонуклеотид присоединяется к первому рибонуклеотиду будущей РНК фосфодиэфирной связью (ФДЭ):
к атому кислорода первого нуклеотида в его 3’ положении
присоединяется атом фосфора второго нуклеотида в его 5’ положении.
Из-за такого образования ФДЭ получается, что в начале РНК свободен 5’ конец,
а в конце РНК свободен 3’ конец,
а направление синтеза РНК получается от 5’ конца к 3’ концу.
(Свободен в том смысле, что не образовал ФДЭ-связи).
При этом синтезируемая РНК антипараллельна ДНК-матрице,
с которой связана водородными связями.
Из-за антипараллельности комплементарных нуклеиновых кислот
ДНК-матрица при транскрипции считывается в направлении от 3’ конца к 5’ концу.
После этого к третьему нуклеотиду матрицы
присоединяется водородными связями комплементарный ему третий нуклеотид РНК,
затем этот третий рибонуклеотид соединяется фосфодиэфирной связью
со вторым рибонуклеотидом будущей РНК и т.д.
Процесс присоединения новых рибонуклеотидов и удлинения РНК
называется элонгацией (продолжением) транскрипции
и продолжается до тех пор, пока в ДНК не встретятся специальные последовательности нуклеотидов –
при их появлении синтез РНК прекращается –
(это прекращение синтеза РНК называется терминацией транскрипции –
так же как прекращение синтеза ППЦ при трансляции
называется терминацией трансляции – см. п.82).
Основной фермент транскрипции(синтеза РНК):
Присоединение новых рибонуклеотидов при синтезе РНК при транскрипции катализируется ферментом РНК-полимеразой.
При начале транскрипции РНК-полимераза соединяется с участком ДНК,
который содержит много аденина и тимина
и поэтому называется ТАТА-участком или ТАТА-боксом.
Синтезированная при транскрипции РНК называется ПЕРВИЧНЫМ ТРАНСКРИПТОМ
или про-РНК, поскольку ещё не является зрелой формой РНК,
а является только предшественницей зрелой РНК.
Для превращения про-РНК в зрелую РНК нужен процессинг про-РНК:
80. 2. Процессинг про-РНК. См. п.76.
Синтезированные при транскрипции РНК (про-РНК)
подвергаются дополнительным видоизменениям,
после которых приобретают способность выполнять свои функции.
Эти процессы называются созреванием про-РНК
или ПРОЦЕССИНГОМ про-РНК.
ПРОЦЕССИНГ про-РНК – это превращение первичного транскрипта
(РНК, полученной при транскрипции)
в молекулу зрелой РНК (мРНК, тРНК, рРНК, малые РНК).
Один из процессов процессинга про-РНК заключается в том, что
некоторые участки про-РНК удаляются,
а остальные участки про-РНК соединяются между собой
(соединяются концы, образующиеся после удаления участков) фосфодиэфирными связями.
Удаляемые при этом участки про-РНК называются ИНТРОНАМИ,
а остальные участки (не удаляемые) называются ЭКЗОНАМИ.
Процесс удаления интронов и соединения называется СПЛАЙСИНГОМ («сшиванием»).
Интроны и экзоны ДНК.
Участки ДНК, которые соответствуют интронам РНК (то есть служили матрицей при синтезе «интронных участков» про-РНК),
тоже называются интронами.
Но из ДНК интроны не вырезаются.
Участки ДНК, которые соответствуют экзонам РНК, тоже называются экзонами.
Осуществляется сплайсинг
специальными комплексами, состоящими из белков и малых ядерных РНК,
которые называются СПЛАЙСО/СОМАМИ.
При этом малые РНК осуществляют функцию катализаторов, то есть являются РИБОЗИМАМИ.
Другой процесс, в котором участвуют рибозимы – это синтез белков п.82:
рибозимом является рибосомальная РНК,
которая участвует в образовании пептидной связи между аминоацилами
при транспептидации во время элонгации трансляции.
Сплайсинг должен протекать очень точно:
при удалении участка, которые всего на один нуклеотид короче или длиннее,
чем нужно,
получится в итоге РНК с совсем другими ТРИПЛЕТАМИ (см. 82),
на которой будет синтезироваться совсем другая ППЦ вместо нужной.
Поэтому нарушения сплайсинга
могут быть причиной нарушений синтеза данного белка,
и приводит к протеинопатиям (см. п. 57 и 79),
даже если нет мутаций в гене, при нормальном гене.
Примеры болезней, в развитии которых есть нарушение сплайсинга:
1) некоторые талассемии (нарушения синтезе глобиновых цепей гемоглобина),
2) системная красная волчанка.
Из одной и той же про-РНК при сплайсинге могут удаляться разные участки.
То есть разные участки про-РНК могут считаться интронами.
(Разные, но строго определённые).
Это явление называется АЛЬТЕРНАТИВНЫМ СПЛАЙСИНГОМ.
Из-за наличия альтернативного сплайсинга
из одной и той же молекулы про-РНК
после сплайсинга могут получиться совершенно разные зрелые мРНК,
то есть с разными последовательностями нуклеотидов, с разными кодонами – п.82.
И при трансляции этих разных мРНК получаются разные ППЦ и разные белки.
По этой причине при 20 000 генов человека у него около 100 000 белков.
По этой же причине ген кодирует не одну ППЦ, а несколько.
80. 3. Обратная транскрипция. См. п.79, 86.
РНК может использоваться не только для синтеза белка (п.82),
но может стать и матрицей для синтеза ДНК.
Процесс синтеза ДНК на матрице РНК называется ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ
(потому что про обычной транскрипции РНК синтезируется на матрице ДНК).
Фермент, катализирующий процесс обратной транскрипции,
называется ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗОЙ или РНК-зависимой ДНК-полимеразой.
Сначала на цепочке РНК синтезируется комплементарная ей цепочка дезоксинуклеотидов (то есть ДНК).
После этого уже эта цепочка ДНК становится матрицей для синтеза второй цепочки ДНК.
Синтез обеих цепочек катализируется обратной транскриптазой,
хотя синтез второй цепочки ДНК на матрице ДНК не является обратной транскрипцией.
В итоге образуется двухцепочечная молекула ДНК,
которая является КОПИЕЙ ГЕНА
(того участка ДНК, который был матрицей при синтезе РНК).
Интеграция в генОм.
Копии генов, полученных благодаря обратной транскрипции,
могут встраиваться в хромосомы.
Процесс встраивания копий генов в хромосомы называется интеграцией в генОм.
При интеграции в хромосому копии гена
может произойти повреждение ДНК – изменение генов или регуляторных участков ДНК (п.81).
Поэтому интеграция в геном является потенциально мутагенным процессом – см. п.79.
Интеграция в геном относится к так называемым ПЕРЕСТРОЙКАМ генома.
И формально не считается разновидностью мутаций.
Как и все перестройки, интеграция в геном может привести: к превращению проонкогена в онкоген и антионкогена в неактивный антионкоген – п.87.
В геном могут встраиваться (интегрироваться) не только копии собственных генов,
но и вирусные ДНК, в том числе ДНК, полученные на матрице вирусной РНК – см. п.86.
Весь процесс получения копий генов и их встраивания в генОм человека
(то есть и обратная транскрипция, и интеграция в генОм)
называется АМПЛИФИКАЦИЕЙ («умножением числа генов»).
Для амплификации нужны:
1) транобычная скрипция гена для получения РНК, которая станет матрицей,
2) обратная транскрипция этой РНК
(синтез на РНК первой цепи ДНК,
затем синтез на первой цепи ДНК – второй цепи ДНК),
3) интеграция в геном полученной двухцепочечной ДНК (копии гена).
Зачем нужны копии генов и процесс копирования?
Для ускорения синтеза белка и увеличения числа молекул белка:
Чем больше «экземпляров» данного гена –
тем быстрее могут синтезироваться РНК при транскрипции,
а чем больше РНК – тем быстрее могут синтезироваться кодируемые ими белки.
Считается, что амплификация помогает быстрее синтезировать некоторые белки во время эмбриогенеза.
Кроме того, на амплификации основан эффект Митридата (см. п. 118 и 119) –
«натренированность к ядам»
(способность не умереть от смертельной для обычного человека дозы яда,
развивающаяся при регулярном приёме малых доз)
и множественная лекарственная устойчивость:
«привыкание к лекарствам», невоспримчивость к лекарствам, возникающая при длительном их употреблении.
Это точка зрения, согласно которой РНК была первой биомолекулой живых организмов:
хранила информацию до появления ДНК и осуществляла катализ до появления многообразия белков.
В пользу этого предположения говорят следующие факты:
1. РНК используются в качестве матриц
и при синтезе ДНК (при обратной транскрипции),
и при синтезе белка (при трансляции) –
это имеют в виду, когда говорят, что РНК может передавать информацию в обоих направлениях – и к ДНК, и к белку.
2. РНК способны и хранить информацию, подобно ДНК (то есть РНК, как и ДНК, могут использоваться в качестве матриц при матричных синтезах – п.77),
и катализировать химические реакции, подобно белкам (конкретные РНК, способные к катализу, называются РИБОЗИМАМИ:
рибозимы участвуют в сплайсинге и в синтезе белка – п.82).
3. РНК участвуют в видоизменениях (редактировании) РНК, синтезированных (транскрибированных) на ДНК, то есть в модификациях первичных транскриптов – см. процессинг РНК и сплайсинг.
За счёт этого РНК видоизменяют исходную информацию, «записанную в ДНК».
4. Дезокси/рибонуклеотиды (мономеры ДНК и субстраты синтеза для ДНК) не выполняют никаких других функций в организме,
а рибонуклеотиды (мономеры РНК и субстраты для синтеза РНК) выполняют в организме ряд функций (п.70):
являются макроэргами (АТФ и другие),
входят в состав коферментов (НАД+ и НАДФН, ФАД, КоА),
являются регуляторами (цАМФ, цГМФ, ГТФ).
Биоинформатика в мире РНК-структур
Понимание, как формируется пространственная конфигурация РНК, необходимо для разработки методов предсказания вторичных структур молекул и определения выполняемых ими функций в клетке живых организмов
рисунок А.В. Головина
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «био/мол/текст»: Амбициозный проект «Геном человека», завершившийся в 2003 году, был призван расшифровать всю ДНК, содержащуюся в человеческом геноме. Считалось, что проект поможет понять, как функционируют гены, каким образом они определяют состояние клетки и организма человека в целом, а также даст толчок развитию медицины и биологических наук. Однако исследования показали, что вся сложность клетки как целостной системы не сводится к одному лишь геному. Функционирование и роль молекулы РНК в регуляции клеточных процессов во многом зависят от ее пространственной организации, изучение которой — сложная задача, справиться с которой под силу только биоинформатике.
Конкурс «био/мол/текст»-2014
Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2014 в номинации «Биоинформатика и молекулярная эволюция».
Главный спонсор конкурса — дальновидная компания «Генотек».
Конкурс поддержан ОАО «РВК».
Спонсором номинации «Биоинформатика» является Институт биоинформатики.
Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.
Свой приз также вручает Фонд поддержки передовых биотехнологий.
Вторичная структура РНК
У прокариот процесс транскрипции и трансляции обычно сопряжен в пространстве и во времени. — Ред.
Дело в том, что РНК, подобно белковым молекулам [4], не существуют в виде простой цепочки. Нуклеотиды РНК взаимодействуют друг с другом, объединяясь в пары по принципу комплементарности, в результате чего молекула нуклеиновой кислоты приобретает причудливую конфигурацию: возникают петли, шпильки, псевдоузлы и другие формы (рис. 1). Если первичная структура — это просто последовательность нуклеотидов, то подобные образования относятся к вторичной структуре. И этот уровень организации молекулы также несет информацию, которая используется в регуляции таких процессов, как транскрипция ДНК, сплайсинг РНК, изменение активности генов с помощью микроРНК, а также транспорт транскриптов в определенные области клетки [5].
Рисунок 1. Разнообразие вторичных структур РНК: а — шпилька с внутренней петлей; б — дуплекс с двумя выступами; в — псевдоузел; г — молотовидный рибозим (hammerhead ribozyme) PDB: 1NYI; д — тРНК PDB: 1J1U; е — РНК из белок-РНКовго комплекса, узнающего и осуществляющего доставку на мембрану синтезируемых на рибосоме мембранных белков (SRP RNA) PDB: 1Z43. Справа от каждой структуры показана ее 3D-модель: предсказанные с помощью вычислительных методов (синий цвет) и полученные экспериментально (желтый цвет).
Вторичная структура также влияет на взаимодействие РНК с молекулами, например, со специфическими белками RBP (RNA binding proteins). Они связываются с РНК с образованием рибонуклеопротеиновых комплексов и регулируют сплайсинг, трансляцию и другие процессы. Если участок связывания «закрыт» петлей, белок не сможет провзаимодействовать с молекулой [6]. Роль вторичной структуры можно также проиллюстрировать воздействием мутаций. В работе Мэтью Халворсена (Matthew Halvorsen), опубликованной в журнале PLoS Genetics в 2010 году, изучались мутации, связанные с заболеваниями человека и находящиеся в регуляторных участках РНК, называемых 5′- и 3′-нетранслируемыми областями. Эти области отвечают за регуляцию процесса трансляции, деградацию РНК, участвуют в РНК-интерференции и при этом сильно структурированы. Мутации могут вызвать серьезные структурные перестройки, что становится причиной таких заболеваний, как наследственный синдром гиперферритинемии-катаракты, ретинобластома или гипертензия [7].
Рисунок 2. Вторичная структура РНК большой рибосомной субъединицы Escherichia coli
При наличии определенных факторов конфигурация РНК может изменяться, что, в свою очередь, влияет на регуляцию генов. Один из лучших примеров специфичности и динамичности вторичной структуры — РНК-переключатели (riboswitch), имеющиеся в клетках бактерий, дрожжей, водорослей и высших растений. Это участки мРНК, которые способны получать информацию о внутриклеточных условиях, связываясь с лигандами. Обычно РНК-переключатели состоят из двух доменов — аптамера, который взаимодействует с лигандами, и домена экспрессии. Как только лиганд (аминокислота, нуклеотиды, ионы металлов) связывается с аптамером, происходят изменения во вторичной структуре примыкающего к аптамеру домена экспрессии, что имеет значение для дальнейшей судьбы мРНК. Например, возникновение шпилек может воспрепятствовать транскрипции или синтезу белка в рибосомах [5]. Структура аптамера, подобно устройству дверного замка, подходит только определенному лиганду, который играет роль ключа
РНК-структуромика
Весь клеточный набор вторичных РНК-структур называется «РНК-струтурóмом» (по аналогии с генóмом или транскриптóмом) [2]. Исследование структурома позволяет ученым понять, как определенные разновидности (мотивы) укладки молекул РНК связаны с участием в различных клеточных процессах, таких как транскрипция, сплайсинг, локализация в клетке, трансляция и регуляция транскриптов. Здесь ученые сталкиваются с определенными проблемами. Недостаточно высокая эффективность методов изучения структуры РНК и сложность получения длинных фрагментов РНК — существенные препятствия на пути к полному описанию структурома. Однако буквально за последние годы технологии секвенирования совершили огромный скачок в развитии. Появились инструменты секвенирования нового поколения, которые позволяют с высокой точностью и относительно быстро определить последовательности ДНК и РНК. Очень важно также использование вычислительных методов, которые сильно продвинулись в своей способности точно предсказывать структуру РНК. При этом все же золотым стандартом определения структуры РНК был и остается эксперимент [5].
Исследования с использованием компьютерных методов привели ко многим открытиям. Например, транспортные РНК обладают структурными особенностями, которые соответствуют их функциям. Для поиска тРНК существуют различные инструменты, например, программа tRNAscan-SE, написанная на популярном среди биоинформатиков языке Perl. Она занимается поиском «подозрительных» участков в геноме, которые могут кодировать тРНК. После тщательного «просеивания» этих участков, остаются гены, которые являются истинными тРНК с вероятностью в 99–100%. Программа ориентируется не только на последовательность нуклеотидов, которая может различаться у разных тРНК, но также на вторичную структуру, являющейся общей для всех тРНК и напоминающей лист клевера. Кроме этого, tRNAscan-SE сравнивает гены-кандидатов с последовательностью, структура которой известна. Если гены-кандидаты формируют такую же структуру, значит они с высокой вероятностью являются тРНК [8].
Естественный отбор имеет значение
Как узнать, что на данной последовательности образуется структура? Для этого нужно, чтобы замена нуклеотида на одном участке последовательности обязательно сопровождалась компенсаторной заменой нуклеотида на другом участке последовательности [9]. Это значит, что оба нуклеотида участвуют в формировании структуры, к примеру, образуя пару G—C или A—U. Структура сохранится, если пара G—C заменится на пару A—U или наоборот. Когда в распоряжении есть достаточное количество гомологов, то, исходя из расположения многих консервативных пар, можно вывести вторичную структуру РНК (рис. 3).
Рисунок 3. Консервативность пар оснований в гомологичных последовательностях является основой для предсказания вторичной структуры. Стрелочками указаны взаимодействующие друг с другом нуклеотиды, которые могут быть различными в ряду последовательностей, однако сохраняющие конфигурацию молекулы (справа).
Вездесущая термодинамика
Когда в распоряжении исследователя имеется не ряд гомологов, а только одна последовательность, имеет смысл воспользоваться термодинамическим моделированием. Предполагается, что молекула РНК правильной структуры находится в состоянии термодинамического равновесия [10]. На основе энергетических параметров данной молекулы, полученных экспериментально, строятся всевозможные конфигурации вторичной структуры. Среди них ищут наиболее устойчивую, которая и будет правильным решением. Для коротких цепочек, длиной менее 700 пар оснований, данный метод корректно определяет структуру для 70% пар. Однако если цепочка длиннее, точность падает вплоть до 20%. Альтернативный подход — использование алгоритмов, основанных на вероятностном моделировании, — к сожалению, сильно уступает термодинамическим методам. Другая возможная стратегия — объединение термодинамического моделирования и машинного обучения [11]. Также с помощью PARS-метода можно выяснить, какие нуклеотиды являются непарными, чтобы исключить их из алгоритма и улучшить точность предсказания.
В методах предсказания вторичной структуры существуют существенные ограничения. Конформационные изменения РНК-переключателей в результате взаимодействия с лигандом настолько сложно смоделировать, что существующие алгоритмы оказываются бесполезными. Также большие трудности вызывает предсказание псевдоузлов, состоящих из двух совмещенных особым образом шпилек (рис. 1). Псевдоузлы встречаются в рРНК, тРНК, а также в геномах вирусных РНК, где они участвуют в процессах трансляции [12]. Для их поиска разрабатывают специальные методы, которые ориентированы на отдельные типы псевдоузлов. Однако с увеличением длины последовательности экспоненциально растет время, затрачиваемое алгоритмом на решение данной задачи. В этих условиях эксперимент становится необходим, позволяя ученым улучшить существующие алгоритмы и разработать новые стратегии поиска.
В игру вступает параллельное секвенирование
В параллельном анализе структуры РНК (или PARS-методе) применяются инструменты секвенирования нового поколения, которые позволяют получить миллионы расшифрованных последовательностей за один единственный эксперимент. Сначала образцам РНК позволяют свернуться с образованием вторичной структуры, затем их подвергают воздействию рибонуклеаз — ферментов, катализирующих расщепление связи между нуклеотидами. В PARS-методе используют два типа рибонуклеаз — V1 и S1. Первая расщепляет спаренные участки, вторая — простую цепь. Полученные фрагменты конвертируют в ДНК и секвенируют. Те фрагменты, которые были обработаны V1, в большинстве случаев обрываются на том нуклеотиде, который участвовал в образовании вторичной структуры. Сравнение большого числа копий одной РНК, позволяет судить об интенсивности расщепления на определенных участках молекулы и определить, формируется ли на этом участке вторичная структура [5].
С помощью PARS в 2010 году Кертес и его коллеги изучили вторичную структуру транскриптома дрожжей, проанализировав приблизительно 4,2 миллиона нуклеотидов в 3 тысячах транскриптов. Ими были обнаружены регуляторные мотивы, например, участок внутренней посадки рибосомы URE2, который позволяет начать синтез белка не с одного из концов мРНК, а с середины молекулы. Это исследование, опубликованное в журнале Nature [13], показало, что PARS-метод способен пролить свет на глобальную структурную организацию мРНК. Было открыто преимущественное расположение вторичных структур в кодирующих участках по сравнению с нетранслируемыми областями, а также их роль в регуляции процесса трансляции, который протекает тем активнее, чем менее структурирован сайт инициации трансляции. Объединение параллельного анализа с программными средствами предсказания конфигурации, а также термодинамическим моделированием, дает в руки ученых мощный инструмент для более глубокого постижения мира РНК-структур, что способствует появлению новых гипотез и открытий, касающихся регуляции клеточных процессов.
Стóит отметить, что данный метод дает весьма приблизительную и косвенную информацию о вторичной структуре РНК. На данный момент разработаны более «продвинутые» экспериментальные методики, основанные на химической модификации неспаренных нуклеотидов и позволяющие получать данные более высокого разрешения (напр. SHAPE). — Ред.
Самая большая РНК-лаборатория в мире
Моделирование вторичной структуры РНК, несмотря на большое количество методов, до сих пор остается сложной задачей. Не все принципы известны, а экспериментальные данные настолько обширны, что на анализ, который проводят небольшие группы ученых, уходит много труда и времени. Чтобы решить эту проблему, в университете Карнеги-Меллон и Стэнфордском университете разработали краудсорсинговый проект EteRNA.
В последние годы все больше серьезных научных проектов идут «в народ» в форме онлайн-игр. Такое явление получило название «гражданской науки». Примером аналогичной инициативы служит аркадная игра FoldIt, нацеленная на предсказание строения белковых молекул: «Тетрис XXI века» [14]. — Ред.
Концепция «мусорной ДНК» неоднократно сильно менялась: лет 10 назад бытовало мнение, что ДНК «активна лишь на 10%», а всё остальное является бесполезным кладбищем генов. В последнее время эти воззрения сильно модифицировались, в который раз подтверждая, что не все так просто: «Сколько сора в нашей ДНК» [16]. — Ред.